B834（DE3）感受態細胞 大腸桿菌系列

B834(DE3)感受態細胞  大腸桿菌系列

B834(DE3)感受態細胞簡要說明│₪↟：
CMbio JM109菌株來源於E.coli K strain╃▩╃，是提取高質量DNA的理想菌株╃▩╃，recA1 和 endA1 的突變有利於克隆DNA 的穩定和高純度質粒 DNA 的提取│◕↟。攜帶 hsdR17基因型背景╃▩╃，使得異源DNA不被內源核酸酶系統降解│◕↟。laqI ^qZΔM15的存在使JM109可用於構建克隆╃▩╃，藍白斑篩選實驗；JM109感受態細胞經特殊工藝製作╃▩╃，經pUC19質粒檢測轉化效率可達1×10⁹cfu/μg│◕↟。
JM109感受態細胞操作說明│₪↟：

1. CMbio JM109感受態細胞放置冰中融化（或放手心或室溫片刻╃▩╃，待菌體處於冰水混合狀態時迅速插入冰中）╃▩╃，加入目的DNA（質粒或連線產物）並用手EP管底輕輕混勻╃▩╃，冰上靜置25分鐘│◕↟。

2. 42℃水浴熱激45秒╃▩╃，迅速放回冰上並靜置2分鐘╃▩╃，晃動會降低轉化效率│◕↟。

1.  向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養基（2YT或LB）╃▩╃，混勻後37℃╃▩╃，200rpm復甦60分鐘│◕↟。

4. 5000rpm離心一分鐘收菌╃▩╃，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊並塗布到含相應抗生素的2YT或LB培養基上│◕↟。
5. 將平板倒置放於37℃培養箱過夜培養│◕↟。
JM109感受態細胞注意事項:

1.  CMbio 感受態細胞在冰上融化│◕↟。
2.  混入質粒或連線產物時應輕柔操作│◕↟。
3. 轉化高濃度的質粒或高效率的連線產物可相應減少終用於塗板的菌量│◕↟。

B834(DE3)感受態細胞  大腸桿菌系列

操作步驟 （以下操作均按無菌條件的標準進行）

1. 取感受態細胞置於冰浴中╃▩╃，如需分裝可將剛融化細胞 懸液分裝到無菌預冷的離心管中╃▩╃，置於冰浴中│◕↟。 注意│₪↟： 一次轉化感受態細胞的建議用量為50-100 μl╃▩╃， 可以根據實際情況分裝使用│◕↟。應注意所用DNA體積不 要超過感受態細胞懸液體積的十分之一│◕↟。以下實驗以 100 μl感受態細胞為例│◕↟。

2. 向感受態細胞懸液中加入目的DNA（100 μl的感受態 細胞能夠被1 ng超螺旋質粒DNA所飽和)╃▩╃，輕彈混勻╃▩╃， 在冰浴中靜置30 min│◕↟。

3. 將離心管置於42℃水浴中放置60-90 sec╃▩╃，然後快速將 管轉移到冰浴中╃▩╃，使細胞冷卻2-3 min╃▩╃，該過程不要搖 動離心管│◕↟。 注意│₪↟：此步驟也可將離心管置於室溫進行╃▩╃，時間不需 十分準確╃▩╃，夏季或室溫較高時╃▩╃，可放置5-8 min左右╃▩╃， 如果室溫較低╃▩╃，可延長時間至8-15 min左右│◕↟。條件允 許建議使用42℃熱激方法│◕↟。

4. 向每個離心管中加入900 μl 無菌的SOC或LB培養基 （不含抗生素）╃▩╃， 混勻後置於37℃搖床振盪培養45 min (150 rpm)╃▩╃，目的是使質粒上相關的抗性標記基因 表達╃▩╃，使菌體復甦│◕↟。 5. 將離心管內容物混勻╃▩╃，吸取100 μl已轉化的感受 態細胞加到含相應抗生素的SOB或LB固體瓊脂 培養基上╃▩╃，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻 塗開│◕↟。將平板置於室溫直至液體被吸收╃▩╃，倒置平 板╃▩╃，37℃培養12-16 h│◕↟。 注意│₪↟：塗布用量可根據具體實驗來調整│◕↟。如轉化 的DNA總量較多╃▩╃，可取更少量轉化產物塗布平 板；反之╃▩╃，如轉化的DNA總量較少╃▩╃，可取200- 300 μl轉化產物塗布平板│◕↟。如果預計的克隆較 少╃▩╃，可透過離心（4000 rpm, 2 min）後吸除部 分培養液╃▩╃，懸浮菌體後將其塗布於一個平板中│◕↟。 （塗布剩餘的菌液可置於4℃儲存╃▩╃，如果次日的轉 化菌落數過少可以將剩下的菌液再塗布新的培養 板）

不同感受態細胞基因型不一樣╃▩╃，因此有不同的用途│₪↟：
1₪☁·₪✘、B834(DE3)感受態細胞  是實驗室常用的感受態╃▩╃，用於克隆的╃▩╃，構建質粒╃▩╃，建庫╃▩╃，儲存質粒╃▩╃，等等│◕↟。
2₪☁·₪✘、DH10β可用於重組克隆的藍/白斑篩選╃▩╃，允許構建更多具有代表性的基因組文庫╃▩╃，可以增加質粒產量和數量
3₪☁·₪✘、 Stbl3可以抑制重組╃▩╃，適合轉化不穩定質粒╃▩╃，可用於儲存慢病毒質粒│◕↟。
4₪☁·₪✘、JM109適合重複基因表達,分子克隆₪☁·₪✘、質粒提取和蛋白質表達╃▩╃，可用於M13克隆序列測定和藍白斑篩選│◕↟。
5₪☁·₪✘、 B834(DE3)感受態細胞  是常用來表達蛋白的╃▩╃，如果用於儲存質粒╃▩╃，質粒會很不穩定│◕↟。
快速轉化操作方法 (10min)
1. 提前15分鐘將用到的篩選培養基平板拿到37℃預熱│◕↟。
2.B834(DE3)感受態細胞  從-80℃拿出╃▩╃，迅速插入冰中╃▩╃，5分鐘後待菌塊融化╃▩╃，加入目的DNA（質粒或連線產物）並用手EP管底輕輕混勻,╃▩╃，冰中靜置5分鐘│◕↟。
3. 用200 μl槍將感受態細胞-DNA混合物轉移到已經37℃預熱的LB培養基上╃▩╃，塗均勻╃▩╃，表面無水漬│◕↟。
4. 將平板倒置放於37℃培養箱過夜培養│◕↟。如果進行藍白斑篩選操作╃▩╃，將平板放37℃培養至少15h│◕↟。
快速熱激轉化操作方法 (25min,可提高轉化效率)
1.B834(DE3)感受態細胞  從-80℃拿出╃▩╃，迅速插入冰中╃▩╃，5分鐘後待菌塊融化╃▩╃，加入目的DNA (質粒或連線產物)並用手P管底輕輕混勻,╃▩╃，冰中靜置5分鐘│◕↟。
2. 42℃水浴熱激45秒╃▩╃，迅速放回冰上並靜置2分鐘 (晃動會降低轉化效率)│◕↟。加入700 μl 不含抗生素的LB╃▩╃，37℃╃▩╃，200 rpm 復甦10分鐘╃▩╃，塗板 (均勻╃▩╃，表面無水漬)│◕↟。
3. 將平板倒置放於37℃培養箱過夜培養│◕↟。如果進行藍白斑篩選操作╃▩╃，將平板放37℃培養至少15h